Latar Belakang: Penyakit bawaan makanan merupakan masalah kesehatan masyarakat yang berkembang di seluruh dunia, salah satunya di Indonesia. Mencuci tangan merupakan hal utama yang harus dilakukan oleh pekerja yang terlibat dalam penanganan makanan. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan perilaku mencuci tangan terhadap angka koloni kuman pada penjamah makanan di seluruh kantin Universitas Tanjungpura Pontianak. Metodologi: Desain penelitian yang digunakan dalam penelitian ini bersifat analitik dengan pendekatan cross sectional. Lima puluh satu orang penjamah makanan bersedia berpartisipasi dalam penelitian ini. Perilaku mencuci tangan dinilai dengan kuesioner dan observasi langsung. Usap tangan diambil untuk menilai angka koloni kuman. Analisa data menggunakan uji Chi-square. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan 32 orang (62,7%) penjamah makanan melakukan perilaku mencuci tangan yang baik dan 19 orang (37,3%) berperilaku mencuci tangan kurang baik, akan tetapi semua penjamah makanan tidak melakukan keenam langkah mencuci tangan dengan baik dan benar. Sampel usap tangan menunjukkan angka koloni kuman sebanyak 17 orang (33,3%) dalam kategori bersih dan 34 orang (66,7%) dalam kategori kontaminasi. Kesimpulan: Terdapat hubungan perilaku mencuci tangan terhadap angka koloni kuman pada penjamah makanan. Penelitian ini menyarankan perlu diberikan pendidikan/penyuluhan higiene sanitasi makanan, tersedianya fasilitas cuci tangan yang memadai dan dukungan/dorongan dari pemilik usaha.