Meningkatnya tingkat resistensi terhadap antibiotik mendorong perlunya pencarian sumber antimikroba baru yang potensial. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari studi sebelumnya yang bertujuan untuk mengeksplorasi aktivitas antimikroba dari fraksi jamur endofit Trichoderma harzianum NT3. Isolat murni T. harzianum NT3 dikultivasi pada media beras padat selama 3–4 minggu pada suhu ruang. Ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut etil asetat (EtOAc), kemudian hasil ekstrak diuapkan dengan Rotary Evaporation. Fraksinasi selanjutnya dilakukan dengan metode cair-cair menggunakan pelarut metanol dan n-heksan. Uji aktivitas antimikroba dari masing-masing fraksi dilakukan terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), dan Candida albicans menggunakan metode difusi agar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi n-heksan merupakan fraksi paling aktif dibandingkan fraksi methanol, dengan diameter zona hambat sebesar 11,50 mm terhadap S. aureus, 12,35 mm terhadap E. coli, 11,20 mm terhadap MRSA, dan 13,50 mm terhadap C. albicans. Temuan ini menunjukkan potensi fraksi n-heksan dari T. harzianum NT3 sebagai sumber senyawa antimikroba. Namun, penelitian lanjutan diperlukan untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang bertanggung jawab atas aktivitas tersebut.