Risiko penyakit kardiovaskular dan obesitas dikaitkan dengan kadar kolesterol yang tinggi. Bakteri Asam Laktat sangat bermanfaat bagi fungsional tubuh manusia sebagai bakteri probiotik. Probiotik memiliki manfaat terapeutik seperti membantu pengobatan laktosa intoleran, mencegah kanker usus besar, dan menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Tujuan dari penelitian ini untuk menentukan potensi probiotik isolat DNH 16 yang di isolasi dari makanan tradisional Sumatera Utara, Dali ni Horbo. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Post Test Only Control Group Design. Metode penelitian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode kertas cakram, uji ketahanan terhadap pH asam, garam empedu dan penurunan kolesterol di lakukan dengan metode spektrofotometer. Uji aktivitas antimikroba Isolat DNH 16 menunjukan aktivitas zona hambat terhadap bakteri S. aureus sebesar 71,5 mm dan bakteri E. coli sebesar 14,5 mm. Uji ketahanan terhadap pH asam kurang baik yaitu sebesar 20,05%. Uji ketahanan terhadap garam empedu cukup tinggi yaitu 95,4%. Penurunan kadar kolesterol secara In vitro cukup baik yaitu 65,85%. Kontrol positif penurunan kolesterol yaitu 14,63%. Kesimpulan yang di dapat dari penelitian ini adalah probiotik isolat DNH 16 dapat menurunkan kadar kolesterol.