Ekspresi Prethrombin-2 Manusia Recombinan dalamPichia pastoris dan Optimasi Kondisi Ekspresinya - Gaffar, Shabarni; Upay, Purba; Maksum, Iman Permana; Hasan, Khomaini; Subroto, Toto; Enus, Sutarya; Soemitro, Soetijoso; Pertiwi, Wulan (Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2017)
Pretrombin merupakan prekursor dari trombin yang memiliki aktivitas proteolitik. Trombin merubah fibrinogen menjadi benang fibrin yang salah satu aplikasinya adalah dapat digunakan sebagai lem untuk menggantikan teknik jahitan pasca bedah. Aplikasi trombin untuk pembuatan lem fibrin menuntut diproduksinya trombin rekombinan. Tujuan dari penelitian ini adalah ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia rekombinan menggunakan sistem ekspresi Pichia pastoris. Gen pengode PT2 dirancang sesuaidengan kodon preferensi P. pastoris. Fragmen PT2 diamplifikasi dengan metoda PCR dengan penambahan sisi restriksi EcoR1 pada ujung 5â dan sisi restriksi SacII pada ujung 3â. Produk PCR yang berukuran 924 pb diligasi dengan vektor ekspresi pPICZaB untuk P. pastoris dan disubkloning dalam inang Escherichia coli. Urutan nukleotida dikonfirmasi dengan metoda dideoxy Sanger. Plasmid rekombinan pPICZaB-PT2 kemudian digunakan untuk mentransformasi P. pastoris SMD1168 defisien protease dengan metoda elektroporasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen PT2 berhasil diamplifikasi dan dikloning dalam E. coli. Analisis restriksi dan penentuan urutan DNA menunjukkan bahwa PT2 rekombinan 100% homologi dengan hasil rancangan. Hasil ekspresi PT2 oleh P. pastoris menggunakan metanol sebagai inducer memperlihatkan bahwa PT2 dengan berat molekul 35 kDa berhasil diekspresikan. Optimasi kondisi ekspresi melalui variasi konsentrasi metanol sebagai inducer dan sorbitol sebagai sumber karbon tambahan menunjukkan bahwa metanol 2% dan sorbitol 2% merupakan kondisi optimum ekspresi PT2.