TRANSFORMASI DAN KLONING PLASMID PJ804:77539 PADA E.coli TOP’10 - Siu S.S Langden; Anto Budiharjo; w wijanarka; Wien Kusharyoto (Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika Undip, 2017)
Kloning dan transformasi vektor PJ804:77539 dilakukan dengan tujuan perbanyakan vektor pRHA pada sel bakteri E.coli TOP’10. Ekpresi vektorpRHA diharapkan dapat terjadi pada periplasma E.coli dan memberikan ekspresi berupa kemampuan resistensi terhadap Ampicillin. Ekspresi pada periplasma bertujuan untuk meminimalisir kerugian yang timbul pada sistem ekspresi di sitoplasma di antaranya tingkat ekspresi yang rendah, protein terpotong atau resiko kontaminasi. Sekresi protein rekombinan pada periplasma dapat meningkatkan aktivitas biologis serta tingkat kestabilan produk menjadi lebih tinggi. Proses isolasi protein yang diekspresikan pada periplasma dapat dilakukan dengan perlakuan stress osmotik ringan sehingga menurunkan resiko kontaminasi protein sitoplasma. Ekspresi protein pada periplasma diarahkan oleh peptida sinyal pelB. Peptida sinyal bekerja menarik produk protein ke periplasma dengan cara berfusi dengan ujung N-terminal pada peptida yang terekspresi. Penanda selektif (selectable marker) yang terdapat pada PJ804::77539 merupakan Ampr, suatu penanda yang memampukan bakteri untuk resisten pada keberadaan antibiotik Ampicillin. Transformasi dilakukan sesuai dengan metode heat – shock dan diseleksi pada medium LB agar dan LB cair yang mengandung antibiotik Ampicillin dengan konsentrasi 100 mg/mL. Diperoleh koloni tumbuh pada medium yang mengandung Ampicillin dan dilakukan isolasi plasmid. Visualisasi hasil elektroforesis memperlihatkan adanya pita plasmid yang diisolasi dari E.coli TOP’10 pada gel elektroforesis.Kata kunci : Ampicillin, E.coli, pelB, periplasm dan pRHA