KLONING FRAGMEN DNA PENGKODE S80-180 GALUR ALAMI DAN MUTAN G145R VIRUS HEPATITIS B PADA ESCHERICHIA COLI JM109 - TINA ROSWATI ROSTINAWATI; debbie sofie retnoningrum (Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, 2016)
Virus hepatitis B (HBV) merupakan penyebab infeksi hepatitis kronis di dunia. Pemberian vaksin yang mengandung protein S dapat menginduksi antibodi protektif melawan semua subtipe HBV. Sebuah mutasi titik pada gen pengkode determinan “a” HBsAg yang menyebabkan substitusi glisin (G) oleh arginin (R) pada posisi 145 (mutan G145R) menurunkan kemampuan pengikatan antibodi yang diinduksi oleh antigen HBsAg galur alami dan ini merupakan salah satu contoh mutan lolos vaksin. Protein rekombinan dapat melengkapi uji imunologi yang saat ini hanya spesifik untuk HBsAg galur alami. Penelitian ini difokuskan pada gen pengkode fragmen S80-180 (merentang residue pada posisi 80 hingga 180 protein S). Tujuan penelitian adalah mengkonstruksi gen pengkode protein S80-180 galur alami dan mutan G145R pada vektor kloning pGEM-T pada Escherichia coli ( E. coli ) JM109. Fragmen DNA pengkode protein S80-180 galur alami dan mutan G145R diamplifikasi dengan reaksi polimerase berantai (PCR) menggunakan cetakan HBV. Produk PCR tersebut diligasikan pada vektor kloning pGEM-T dan hasil ligasi ditransformasikan ke E. coli JM109. Transforman diskrining dengan ampisilin dan sistem seleksi biru / putih. Plasmid dari transforman putih resisten ampisilin diisolasi dan dikarakterisasi dengan analisis migrasi, PCR, pemotongan ganda, dan penentuan urutan nukleotida DNA sisipan. Hasil analisis migrasi menunjukkan bahwa pGEM-T rekombinan bermigrasi lebih lambat dibandingkan dengan pGEM-T non rekombinan. PCR menggunakan primer T7 dan SP6 menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 500 pasangan basa (pb) yang hampir sama dengan ukuran teoritis , 545 pb. . Analisis pemotongan dengan enzim BamHI dan NdeI memberikan pita DNA sisipan yang berukuran di bawah 500 pb (secara teoritis 339 pb) dan pGEM-T linier yang berukuran sekitar 3000 pb. Analisis terhadap hasil penentuan urutan nukleotida menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Tool) menunjukkan bahwa DNA sisipan untuk gen pengkode S80-180 galur alami dan mutan G145R memiliki homologi 99% dengan urutan nukleotida gen S (kode akses GenBank AB113220.1 dan AB 113238.1). Hasil pensejajaran urutan nukleotida gen pengkode S80-180 galur alami dengan mutan G145R