EVALUASI KONSTRUKSI DNA DA+LAM VEKTOR PLASMID BERKAITAN DENGAN EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN ROPHTRY-1 (ROP1) TOXOPLASMA GONDII PADA ESCHERICIA COLI - Purwaningtyas Kusumaningsih (LPPM Universitas Dhyana Pura, 2018)
ABSTRAKEvaluasi terhadap konstruksi DNA pada vector plasmid yang membawa gen rophtry-1 Toxoplasma gondii dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui faktor-faktor penyebab kegagalan ekspresi protein rekombinan Rophtry-1 (ROP1). Gen rophtry-1 yang mengkode protein ROP1, dipotong dari plasmid rekombinan pGEMT/R1 menggunakan enzim restriksi EcoRI dan diligasi ke plasmid pET32a(+) untuk diekspresikan. Plasmid ditransformasi ke dalam bakteri Eschericia coli (BL21). Plasmid rekombinan dianalisis dengan metode polymerase chain reaction (PCR) untuk menentukan klon positif. Analisis sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui proses ekspresi gen didalam plasmid. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR diperoleh fragmen DNA sebesar yang diperkirakan yaitu 1.51 kbp dan 2.10 kbp. Fragmen gen penyandi protein ROP1 berhasil di subklon pada pET32a(+) pada E. coli BL21, tetapi tidak dapat diekpresikan karena terjadi pergeseran pembacaan kodon, sehingga menghasilkan dua premature stop kodon (TGA) sebelum memasuki start kodon (ATG) gen penyandi protein ROP1.Kata kunci: cloning, ekspresi gen, frame shift Evaluation on the DNAABSTRACTconstruction on plasmid vector contains Toxoplasma gondii rophtry-1 gene was to determine the factors causing failure on Rophtry-1 (ROP1) recombinant protein expression. The rophtry-1 gene encoding the ROP1 protein was cleavage from the pGEMT/R1 recombinant plasmid using the EcoRI restriction enzyme and ligation to the pET32a(+) plasmid to expressed. Plasmids are transformed into Escherichia coli (BL21). Recombinant plasmids were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) method to determine positive clones. DNA sequencing analysis was carried out to determine the gene expression process in the plasmid. The results of DNA amplification by PCR obtained DNA fragments as of the expected size i. e. 1.51 kbp and 2.10 kbp. The gene fragment encoding rophtry-1 protein was successfully subcloned on pET32a (+) in E. coli BL21, but could not be expressed because there was a shift in the codon reading, resulting in two premature stop codons (TGA) before entering the start codon (ATG) of the ROP1 protein coding gene.Keywords: cloning, gene expression, frame shift