Pado adalah pangan fermentasi tradisional dari Provinsi Sumatra Barat, terbuat dari ikan pelagis yang dicampur dengan ampas kelapa dan cacahan daging biji picung (Pangium edulee) kering. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang dominan ditemukan pada produk fermentasi dan umumnya dapat mensekresikan metabolit yang berperan dalam membantu memperpanjang masa simpan produk pangan. Supernatan bebas sel yang dinetralkan (NCFS) dari isolat tersebut diduga mengandung peptida bioaktif, yaitu peptida antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan NCFS murni parsial yang dihasilkan oleh isolat asal pado dengan aktivitas penghambatan terbaik terhadap Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus menggunakan metode agar difusi. NCFS kasar diperoleh dari tujuh isolat pado dengan sentrifugasi media pertumbuhannya dan menetralkan supernatannya. Sifat protein dari NCFS kasar dikonfirmasi dengan memaparkan enzim pepsin proteolitik. Ultrafiltrasi digunakan untuk memurnikan NCFS kasar secara parsial. Peptida antibakterinya dikarakterisasi menggunakan liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Semua NCFS menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap S. Typhimurium, tetapi hanya tiga isolat yang menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap S. aureus. Isolat Lactiplantibacillus plantarum B3Iw4 dipilih untuk penelitian lanjut. Fraksi NCFS dengan berat molekul rendah (dalam rentang 317,20 Da hingga 1.494,70688 Da) setelah ultrafiltrasi dengan membran 3 kDa menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik tiga kali lipat terhadap S. aureus dibandingkan dengan NCFS kasar. Analisis LC-HRMS mengidentifikasi 20 peptida dalam NCFS murni parsial. Satu peptida, AAERAGAAALAMHGR, diprediksi memiliki aktivitas antibakteri setelah dicocokkan dengan basis data BIOPEP-UWM, dengan sekuen yang cocok AA. Peptida ini memiliki sifat hidrofobisitas yang relatif tinggi dan menarik untuk diteliti lebih lanjut.