Penggunaan antibiotik tanpa resep merupakan salah satu faktor yang berkontribusi meningkatkan terjadinya resistensi antimikroba, yang saat ini menjadi permasalahan kesehatan global. Apotek memiliki peran penting dalam memastikan penggunaan antibiotik yang rasional. Namun, informasi mengenai kepatuhan apotek terhadap regulasi pelayanan antibiotik tanpa resep masih terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kepatuhan apotek terhadap regulasi tersebut menggunakan pendekatan mystery shopper. Penelitian kuantitatif deskriptif dengan pendekatan cross-sectional dilakukan menggunakan metode mystery shopper pada 96 apotek di wilayah Kabupaten Kudus dan Jepara yang dipilih secara acak. Mystery shopper berperan sebagai pasien dewasa yang mengalami keluhan batuk pilek selama dua hari dan meminta antibiotik tanpa membawa resep dokter. Data yang dikumpulkan meliputi pemberian antibiotik tanpa resep, jenis antibiotik yang diberikan, keberadaan apoteker dan edukasi penggunaan obat. Data dianalisis secara deskriptif menggunakan distribusi frekuensi dan persentase. Dari 96 apotek yang dikunjungi, sebanyak 73 apotek (76,04%) memberikan antibiotik tanpa resep dokter, sedangkan 23 apotek (23,96%) menolak permintaan tersebut. Amoksisilin merupakan antibiotik yang paling sering diberikan (75,34%), diikuti cefadroksil (20,55%) dan azitromisin (4,11%). Hanya sekitar 35 (36,46%) apotek yang memberikan edukasi dan kehadiran apoteker ditemukan lebih sering pada apotek yang patuh terhadap regulasi. Oleh karena itu masih diperlukan optimalisasi peran apoteker untuk mendukung penggunaan antibiotik yang rasional.