Hiperpigmentasi adalah gangguan warna kulit yang berubah menjadi hitam atau cokelat kehitaman akibat produksi pigmen kulit berlebih yang dipicu oleh paparan sinar matahari. Salah satu cara untuk mengatasi hiperpigmentasi adalah dengan menghambat sintesis melanin menggunakan agen depigmentasi yang bekerja dengan menghambat aktivitas enzim tirosinase. Senyawa flavonoid dan fenolik adalah senyawa metabolit pada tumbuhan yang berpotensi menghambat aktivitas enzim tirosinase. Jamur susu harimau atau Lignosus rhinocerus (L. rhinocerus) mengandung banyak senyawa flavonoid, terpenoid, dan senyawa fenolik. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi penghambatan aktivitas enzim tirosinase dari ekstrak etanol L. rhinocerus secara in vitro. Metode: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen laboratorium dengan uji skrining fitokimia untuk alkaloid, flavonoid, saponin, steroid/triterpenoid, dan uji fenolik. Kemudian dilakukan uji fenolik total menggunakan standar asam galat dengan spektrofotometri Vis dengan panjang gelombang λ 750 nm. Selanjutnya, dilakukan uji inhibisi enzim tirosinase pada ekstrak etanol jamur susu harimau. Hasil: Hasil uji skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak tersebut positif mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, steroid/terpenoid, dan metabolit sekunder fenolik, tetapi negatif mengandung senyawa tanin. Pengujian kandungan fenolik total ekstrak L. rhinocerus mengandung 44,93 mg GAE/g. Aktivitas inhibisi ekstrak etanol L. rhinocerus menunjukkan hasil IC50 sebesar 69.292 ppm yang termasuk dalam kategori sedang. Sementara itu, nilai IC50 standar asam kojik yang digunakan adalah 13.585 ppm yang memiliki aktivitas inhibisi kategori tinggi. Kesimpulan: Dari hasil analisis data, diperoleh nilai signifikansi sebesar 0,025 (p0,05), yang berarti terdapat perbedaan signifikan pada hasil penghambatan enzim tirosinase antara kelompok L. rhinocerus dan asam kojik.