Pemerintah telah mengeluarkan Surat Dirjen Pelayanan Kesehatan pada tanggal 10 Desember 2018 tentang Permohonan Penggunaan Sistem Rujukan Terintegrasi (SISRUTE) kepada seluruh Dinkes kab/kota/provinsi. Menyadari hambatan serta pentingnya penggunaan SISRUTE dengan baik, dalam penerapan SIM perlu adanya pemahaman bagaimana penggunaan sistem informasi pada institusi tersebut. Penelitian ini bertujuan menganalisis faktor-faktor yang mempengaruhi Penggunaan Aplikasi Sistem Rujukan Terintegrasi (SISRUTE) di Puskesmas Kota Makassar. Sampel dalam penelitian ini adalah pengguna langsung aplikasi SISRUTE di Puskesmas Kota Makassar sebanyak 39 responden. Penelitian ini menggunakan jenis penelitian kuantitatif dengan riset survei. Analisis data yang dilakukan adalah analisis univariat dan analisis bivariat. Hasil penelitian ini menunjukkan ada pengaruh antara persepsi kemudahan terhadap penggunaan Sistem Rujukan Terintegritasi (SISRUTE) di Puskesmas Kota Makassar (p = 0,011); ada pengaruh antara minat menggunakan terhadap penggunaan Sistem Rujukan Terintegritasi (SISRUTE) di Puskesmas Kota Makassar (p = 0,025); tidak ada pengaruh antara keadaan pendukung terhadap penggunaan Sistem Rujukan Terintegritasi (SISRUTE) di Puskesmas Kota Makassar (p = 1,000), dan tidak ada pengaruh antara persepsi manfaat terhadap penggunaan Sistem Rujukan Terintegritasi (SISRUTE) di Puskesmas Kota Makassar (p = 0,647). Responden yang sering menggunakan SISRUTE menyatakan bahwa aplikasi SISRUTE mudah digunakan, bahkan bisa digunakan kapan saja dan dimana saja. Beberapa alasan responden jarang menggunakan SISRUTE disebabkan karena Puskesmas jarang memiliki pasien yang serius atau gawat darurat untuk dirujuk ke Rumah Sakit, keterlambatan jawaban rumah sakit dan terkadang informasi ketersediaan ruang rawat tidak valid serta ketidakstabilan koneksi internet. Dapat disimpulkan bahwa persepsi kemudahan dan minat menggunakan mempengaruhi penggunaan aplikasi SISRUTE di Puskesmas Kota Makassar.