Resistansi antimikroba (Antimicrobial Resistance/AMR) pada Escherichia coli merupakan isu global yang berdampak pada kesehatan manusia, hewan, dan lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi Escherichia coli dari air minum ternak dan ambing sapi perah di Desa Kabawetan, Kabupaten Kepahiang, Provinsi Bengkulu, serta mengevaluasi profil resistansi antibiotiknya. Penelitian dilaksanakan pada April hingga Juni 2024 dengan menggunakan rancangan deskriptif–eksploratif. Sampel terdiri atas air minum ternak (wadah, sumur, dan sumber irigasi) serta usap ambing dari 15 ekor sapi. Identifikasi dilakukan melalui kultur pada media MacConkey dan Eosin Methylene Blue Agar (EMB) agar, pewarnaan Gram, serta uji biokimia (Indole, Methyl Red (MR), Voges–Proskauer (VP), Citrate, Triple Sugar Iron Agar (TSIA), dan Sulfida Indol Motilitas (SIM)). Uji kepekaan antibiotik dilakukan menggunakan metode difusi cakram Kirby–Bauer terhadap 14 jenis antibiotik, dengan interpretasi hasil berdasarkan CLSI (2022). Dari 18 isolat yang diperoleh, sebagian besar menunjukkan karakteristik khas Escherichia coli (Indole positif, MR positif, VP negatif, Citrate negatif, koloni berkilau hijau metalik pada EMB). Hasil pengujian resistansi menunjukkan tingkat resistansi tinggi terhadap β-laktam klasik (ampisilin, amoksisilin, oksasilin), sulfonamida, asam nalidiksat, dan streptomisin; resistansi sedang terhadap tetrasiklin dan fluorokuinolon; serta masih memiliki kepekaan yang relatif baik terhadap sefotaksim, seftriakson, ciprofloksasin (parsial), dan gentamisin. Sebanyak 72% isolat dikategorikan sebagai multidrug resistant (MDR). Temuan ini menunjukkan bahwa ambing sapi perah dan air minum ternak dapat berperan sebagai reservoir Escherichia coli resisten multidrug (MDR) di wilayah Bengkulu. Informasi ini penting untuk pengendalian mastitis, peningkatan sanitasi air, serta penggunaan antibiotik yang bijak dalam kerangka pendekatan One Health.