Jamur kuping hitam (Auricularia polytricha (Mont.) Sacc.) memiliki senyawa metabolit sekunder yang dapat digunakan dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Jamur anggota spesies Aspergillus flavus merupakan mikroorganisme yang bersifat patogen, karena dapat menghasilkan toksin. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan ekstrak methanol jamur kuping hitam dalam menghambat pertumbuhan jamur anggota spesies A. flavus (UH 26). Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura, Pontianak, pada bulan Februari hingga bulan Mei 2017. Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode apus Kirby-Bauer dan metode difusi sumuran. Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 7 taraf perlakuan yaitu kontrol negatif akuades steril 1 ml, control positif ketokonazol 0,02 g/ml, serta konsentrasi ekstrak methanol A. Polytricha 0,20 g/ml, 0,25 g/ml, 0,30 g/ml, 0,35 g/ml dan 0,40 g/ml. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak empat kali sehingga diperoleh 28 unit percobaan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa diameter zona hambat terbesar pada konsentrasi 0,40 g/ml dengan nilai rerata 33,36 mm dan diameter zona hambat terkecil pada konsentrasi 0,20 g/ml dengan nilai rerata 14,08 mm. Konsentrasi 0,40 g/ml merupakan kosentrasi yang memberikan respon hambatan sangat kuat dan tidak berbeda nyata dengan respon hambatan oleh ketokonazol 0,02 g/ml, sehingga dapat dinyatakan sebagai konsentrasi yang terbaik dalam menghambat jamur anggota spesies A. flavus (UH 26).