Kombucha merupakan minuman hasil fermentasi dengan bantuan simbiosis antara bakteri dan beberapa jenis khamir yang memiliki manfaat sebagai antimikrob. Substrat umum kombucha adalah teh hitam yang mengandung polifenol dan memiliki efek antimikrob.Tanaman dan ramuan herbal lain dapat digunakan sebagai substrat kombucha salah satunya kulit manggis. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu optimal pada fermentasi kombucha teh hitam dan kombucha teh kulit manggis dalam menghambat pertumbuhan Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhi, dan Microsporum canis. Metode penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Uji aktivitas antimikrob kombucha dengan metode sumuran. Hasil penelitian menunjukkan semakin lama waktu fermentasi maka nilai pH akan semakin menurun dan zona hambat yang terbentuk akan semakin besar. Zona hambat kombucha teh hitam dan kombucha teh kulit manggis dengan lama fermentasi 14 hari berbeda nyata dan merupakan fermentasi yang optimal serta memiliki potensi kategori daya hambat kuat. Zona hambat paling besar terhadap S.epidermidis dihasilkan pada kombucha teh kulit manggis fermentasi 14 hari dengan luas zona hambat14,84 mm dibandingkan S.typhi dengan luas zona hambat 13,81 mm. Kombucha teh hitam dan kombucha teh kulit manggis berpotensi menghambat pertumbuhan S.epidermidis dan S.typhi namun tidak mampu menghambat pertumbuhan M.canis.