Ikan nila (Oreochromis niloticus) dan ikan kembung (Scomber canagorta) merupakan jenis ikan yang dikonsumsi hanya bagian daging sedangkan bagian gastrointestinal (GI) dibuang sebagai limbah terhadap lingkungan. Bagian GI ikan-ikan ini mengandung banyak jenis dari bakteri yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber bakteri penghasil protein sel tunggal (PST) dengan proses fermentasi. Aplikasi pemanfaatan protein yang bersumber dari bakteri lebih sering digunakan dibandingkan sumber dari hewan dan fungi, hal ini dikarenakan proses pertumbuhan dan regenerasinya yang sangat cepat. Tujuan penelitian ini adalah memperoleh kondisi optimum dalam produksi protein dan penentuan kadar protein yang didapat dari GI ikan nila (O. niloticus) dan ikan kembung (S. canagorta) menggunakan metode Bradford dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Isolat-isolat terpilih dari sumber ikan nila (O. niloticus)Â adalah N1, N2, dan N3 sedangkan sumber ikan kembung (S. canagorta) adalah K1, K2, dan K3. Tahapan dalam penentuan kondisi optimum produksi PST adalah penentuan waktu fermentasi, temperatur dan pH. Isolat terpilih dari sumber ikan nila (O. niloticus) dan ikan kembung (S. canagorta) N3 dan K3 berdasarkan kondisi optimum produksi PST. Waktu fermentasi optimum dari isolat N3 dan K3 adalah 36 jam, temperatur optimum dari isolat N3 dan K3 yaitu 40oC dan derajat keasaman optimum dari isolat N3 dan K3 adalah pH 7. Hasil penelitian terhadap kondisi optimum produksi PST pada isolat N3 dan K3 memiliki kondisi optimum yang sama yaitu waktu fermentasi 36 jam, temperatur 40oC dan pH 7 dengan kadar PST masing-masing untuk isolat terpilih N3 dan K3 yaitu 1,123 dan 1,039 mg/ml. Kata kunci : Protein sel tunggal, Oreochromis niloticus, Scomber canagorta, pH, temperatur, fermentasiÂ