Ruang Infeksi Menular Lewat Transfusi Darah (IMLTD) di Palang Merah Indonesia (PMI) merupakan salah satu ruang pelayanan kesehatan yang tidak lepas dari adanya kontaminasi bakteri. Apabila ruangan terkena kontaminasi bakteri maka akan terjadi beberapa hal, terdapat cemaran pada produk darah serta suhu udara terlalu panas pada ruangan tersebut mengakibatkan kelembapan pada ruangan sehingga terdapat bakteri dan mengontaminasi produk darah. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif yang tumbuh pada media Nutrient Agar (NA) dan Mac Concay Agar (MCA) pada ruang IMLTD UDD PMI Kota Yogyakarta. Metode penelitian yang digunakan yaitu True Experiment dengan pendekatan The Posttest Only Design yaitu hasil observasi memberikan informasi yang bersifat deskriptif. Media yang digunakan pada penelitian ini yaitu Nutrient Agar (NA) dan Mac Concay Agar (MCA). Pada penelitian terdapat 5 titik peletakan media pada cawan petri, pada posisi 1 peletakan media di dekat tempat untuk membersihkan alat alat dan di dekat meja yang berhadapan langsung dengan alat Chemiluminescence Immunoassay (CLIA), untuk posisi 2 cawan petri di atas meja untuk memutar sampel dan di dekat refrigerator, untuk posisi 3 di bawah dan atas alat Architec, posisi 4 terletak di samping alat Qwalys untuk konfirmasi golongan darah serta posisi 5 berada di dekat alat Evolis yang di sampingnya terdapat blood bank untuk darah karantina. Jumlah sampel yang digunakan yaitu 20 sampel, yakni 10 sampel media NA dan 10 sampel media MCA. Hasil penelitian 20 sampel yang diambil dari 5 titik di ruang IMLTD menghasilkan pertumbuhan bakteri dengan perincian 4 sampel bakteri Gram Positif basil, 11 sampel bakteri Gram Negatif basil dan 5 sampel bakteri Gram Negatif kokus serta 1 sampel bakteri Gram Positif kokus. Kesimpulan dari penelitian ini yaitu bakteri yang paling banyak ditemukan dari hasil identifikasi di UDD PMI Kota Yogyakarta yaitu bakteri Gram Negatif dengan bentuk batang (basil).