Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh kualitas spermatozoa sapi SO yang di simpan pada suhu ruang. Materi yang digunakan adalah semen pejantan yang bersumber dari 2 (dua) ekor sapi SO yang telah terlatih untuk diambil semennya. Semen yang di hasilkan di tampung dengan metode vagina buatan yang dilakukan setiap 3 hari sekali penampungan. Sedangkan rancangan percobaan dalam penelitian terdiri dari 3 perlakuan dan 10 ulangan sehingga diperoleh 30 unit percobaan antara lain: P1 : Pengencer tris (PT) 90% + kuning telur (KT) 10%; P2: PT 80% + KT 20% dan P3: PT 70% + KT 30%. Adapun variabel dalam penelitian ini meliputi variabel makroskopis yakni volume, warna, konsistensi, pH bau). Sedangkan variabel makroskopis antara lain gerakan massa, gerakan individu, konsentrasi, viabilitas dan abonormalitas. Semua data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis of variance dan dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil. Hasil analisis of variance pada perlakuan P2 berbeda nyata (P<0,05) dengan P1 dan P2 terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa sapi SO. Hasil ini dapat disimpulkan bahwa penambahan level kuning telur yang berbeda memberikan pengaruh terhadap motilitas spermatozoa dengan level kuning telur sebaiknya menggunakan maksimal 20%.