Asam folat merupakan vitamin yang berperan dalam pembentukan satu per tiga dari sel darah merah, sehingga kekurangan vitamin tersebut berpengaruh terhadap sintesis DNA yang dapat menyebabkan gangguan anemia. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui hubungan antara tingkat pengetahuan terhadap sikap dan praktik penggunaan asam folat bagi ibu hamil selama masa kehamilan di Puskesmas Karang Pule Wilayah Kota Mataram pada tahun 2023. Penelitian ini menggunakan rancangan cross-sectional dimana instrumen yang digunakan yaitu instrumen KAP yang telah dialih bahasakan. Analisis statistika yang digunakan adalah analisis Spearman rank. Jumlah responden yang terlibat dalam penelitian ini yaitu 43 sampel dengan mayoritas usia responden 26-35 tahun. Hasil penelitian menunjukkan karakteristik tingkat pendidikan ibu hamil berkorelasi terhadap tingkat pengetahuan (r=0,285) dan sikap (r=0,019) terhadap asam folat, sedangkan jarak tempuh ke fasilitas kesehatan berkorelasi baik terhadap tingkat pengetahuan (r=0,086), sikap (r=0,126) dan praktik (r=0,326) ibu hamil terhadap penggunaan asam folat. Rata-rata skor pengetahuan dan praktik responden berada pada rentang cukup dan skor sikap responden menginterpretasikan hasil yang baik. Berdasarkan analisis statistik diketahui bahwa pengetahuan memiliki hubungan yang lemah terhadap sikap (r=0,297) dan praktik (r=0,113) ibu hamil terkait penggunaan folat, sedangkan sikap ibu hamil berhubungan kuat terhadap praktik penggunaan asam folat dengan r=0,645. Kesimpulan dari penelitian ini adalah pengetahuan ibu hamil memiliki hubungan yang lemah terhadap sikap dan praktik terkait penggunaan folat, sedangkan sikap dengan praktik memiliki hubungan kuat.