Percepatan pencapaian tiga zero menjadi keharusan bagi pemerintah dan stekholder terkait dalam pelaksanaan program penanggulangan HIV-AIDS, yang meliputi zero infeksi baru, zero kematian terkait AIDS dan zero stigma dan diskriminasi menuju Indonesia bebas AIDS di tahun 2030. Jika tidak dikelola petugas kesehatan yang profesional maka hal tersebut tidak akan tercapai. Tujuan dari penelitian ini yaitu menganalisa hubungan antara variabel pengalaman kerja, motivasi dan struktur organisasi dengan kinerja pengelola program HIV/AIDS Puskesmas di wilayah kerja Dinas Kesehatan Kabupaten Banyuasin tahun 2023. Metode penelitian ini adalah penelitian observasional analitik dengan rancangan cross sectional pengelola program HIV/AIDS Puskesmas di wilayah kerja Dinas Kesehatan Kabupaten Banyuasin. Analisis data secara univariat berupa distribusi frekuensi dan bivariat menggunakan Chi-square. Hasil penelitian ini yaitu ada hubungan pengalaman kerja dengan kinerja (p-Value = 0,023), struktur organisasi dengan kinerja (p-Value = 0,001) dan tidak ada hubungan antara motivasi dengan kinerja (p-Value = 0,056). Diharapkan kepala dinas kesehatan untuk melakukan monitoring dan evaluasi perumusan struktur organisasi di puskesmas secara berkala dan memastikan terdapat pembagian tugas pekerjaan sesuai dengan kemampuan yang terdistribusi secara merata dan diinformasikan secara formal kepada setiap petugas kesehatan di puskesmas.