Obat tradisional secara turun-temurun telah digunakan untuk pengobatan, salah satu pilihan alternatif pengobatan yang efektif dan relatif aman. Mahasiswa merupakan kaum cendekiawan dan mempunyai tingkat pengetahuan yang lebih luas jika dibandingkan dengan masyarakat pada umumnya. Tujuan dilakukan penelitian ini yaitu untuk mengidentifikasi dan melihat perbedaan tingkat pengetahuan, sikap, dan perilaku mahasiswa kesehatan dan non kesehatan di Universitas Muhammadiyah Surakarta terhadap penggunaan obat tradisional. Metode pada penelitian ini adalah metode non eksperimental dengan descriptive comparative. Sampel diambil dengan teknik purposive sampling. Jumlah sampel pada penelitian ini sebanyak 139 mahasiswa yang terbagi menjadi 2 kelompok, 80 mahasiswa kesehatan dan 59 mahasiswa non kesehatan. Alat ukur yang digunakan yaitu kuisioner google form. Data dianalisis dengan uji T-Test dan uji Mann-Withney. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat pengetahuan mahasiswa kesehatan dan non kesehatan masuk dalam kategori sedang dengan nilai rata-rata 78,33 dan 76,08. Sikap kedua kelompok sama-sama memiliki sikap postif dengan nilai rata-rata 22,05 dan 20,18. Perilaku kedua kelompok sama-sama memiliki perilaku baik dengan nilai rata-rata 18,187 dan 17,525. Hasil analisis dengan uji Mann-Withney menunjukkan tingkat pengetahuan antara mahasiswa kesehatan dan non kesehatan tidak terdapat perbedaan (p= 0,768). Sikap berdasarkan uji Independent-Samples T Test menunjukkan adanya perbedaan antara kelompok (p= 0,001). Berdasarkan uji Mann-Withney juga tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok (p= 0,108).