Pendidikan menjadi pilar penting yang harus mendapat perhatian yang lebih. Oleh karena itu, perlu adanya upaya perbaikan mutu salah satunya adalah pemilihan penilaian yang baik dan sesuai. Portofolio merupakan salah satu penilaian atau asesmen yang dijadikan alat untuk menggali informasi tentang pemahaman mahasiswa agar lebih aktif, tenaga pengajar hanya menfasilitasi. Asesmen portofolio dapat menciptakan proses pembelajaran yang inovatif dan mampu membangkitkan motivasi mahasiswa untuk memperkaya pengalaman belajarnya dan memfasilitasi mahasiswa untuk berinteraksi dengan lingkungannya. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui peningkatan hasil belajar mahasiswa dari penerapan asesmen portofolio pada mata kuliah Biologi Dasar di Program Studi Pendidikan Matematika, Universitas Muhammadiyah Kupang selama satu semester. Penelitian ini menggunakan pendekatan kualitatif yang bersifat deskriptif dengan analisis induktif, sedangkan jenis penelitian ini eksperimen semu dengan pretest posttest one group design, pengambilan data dilakukan secara langsung dari berkas portofolio dan arsip yang dimiliki mahasiswa untuk mata kuliah Biologi Dasar. Instrumen berupa tes, observasi dan dokumen. Analisis data kuantitatif dengan menghitung nilai rata-rata (mean), nilai yang sering didapat (modus), dan nilai tengah (median), serta Nilai Gain (N-Gain) sedangkan data kualitatif dianalisis dengan deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan nilai dari enam jenis tes yaitu pre-tes rata-ratanya 70,40, presentasi diskusi rata-ratanya 73,60, kuis rata-ratanya 74,41, makalah rata-ratanya 75, laporan praktikum rata-ratanya 79,80 dan post-tes diperoleh rata-rata 87,53, sedangkan hasil produk portofolio mahasiswa menunjukkan rata-rata kriteria Sangat Baik. Hal ini membuktikan bahwa adanya pengaruh positif penugasan portofolio bagi mahasiswa dengan peningkatan hasil belajar mahasiswa.