Serai wangi merupakan salah satu tanaman perkebunan penghasil minyak atsiri yang memiliki potensi ekonomi yang cukup tinggi. Daun serai wangi dapat diolah menjadi minyak atsiri melalui proses distilasi dengan memberikan perlakuan pendahuluan pada daun menggunakan microwave. Perlakuan diharapkan dapat meningkatkan rendemen. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui pengaruh tebal tumpukan daun serai wangi (Cymbopogon nardus (L) Rendle) pada perlakuan dengan microwave terhadap peningkatan rendemen minyak serai wangi. Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 6 perlakuan dan 3 ulangan. Perlakuan pada penelitian ini adalah tebal tumpukan daun serai wangi dengan pemaparan oven microwave selama 5 menit yaitu p1 (kontrol), P2 (Tebal tumpukan 5 helai), P3 (Tebal tumpukan 10 helai), P4 (Tebal tumpukan 15 helai), P5 (Tebal tumpukan 20 helai), P6 (Tebal tumpukan 25 helai). Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan analisis Duncan’s New Multiple Range Test (DNMRT) pada taraf signifikansi 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan tebal tumpukan daun serai wangi pada saat pemaparan oven microwave berpengaruh nyata terhadap rendemen minyak serai wangi. Perlakuan terbaik untuk meningkatkan rendemen minyak serai wangi adalah pada perlakuan tebal tumpukan daun 25 helai daun serai wangi dengan nilai rata-rata rendemen 1,55% di mana terjadi peningkatan 158,33% dibandingkan tanpa pemaparan dengan microwave. Karakteristik minyak dari perlakuan terbaik yaitu bobot jenis 0,890, indeks bias 1,467, warna kuning kehijauan, dan kadar sitronella 15,85%.