Pufferfish are a species known for their toxic content, tetraodotoxin (TTX). Tetrodotoxin levels in pufferfish are influenced by their habitat and diet. This study aimed to analyze the cytotoxicity and identify active compounds in pufferfish in the waters of Tiwatobi Village. This research began with sampling in the waters of Tiwatobi Village, then the samples were prepared in the Fisheries Product Technology processing room, Larantuka Teacher Training and Technology Institute. The samples were extracted with 75% ethanol using the maceration method. The extracted samples were analyzed for cytotoxicity using the Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Furthermore, the active compounds in the pufferfish ethanol extract were identified using GC-MS. The results of the study showed the cytotoxicity of pufferfish extract, expressed as an LC50 value of 49.479 ppm, which is categorized as moderately toxic. Compound analysis using GC-MS revealed 10 active compounds, consisting of: Ethyl Acetate, Di-n-propyl ether, Propane, 1-ethoxy-2-methyl, Propanoic acid- ethyl ester, Disulfide- dimethyl, Dimethyl Sulfoxide, S-Methyl methanethiosulfinate, Cyclotetrasiloxane- octamethyl, S-Methyl methanethiosulphonate dan Cyclopentasiloxane, decamethyl-. ABSTRAKIkan buntal merupakan spesies ikan yang terkenal dengan kandungan racunnya yaitu tetraodotoksin (TTX). kandungan tetrodotoksin yang terdapat pada ikan buntal dipengaruhi oleh hábitat dan makanannya. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis sitotoksisitas dan itentifikasi senyawa aktif pada ikan buntal di perairan Desa Tiwatobi. Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel diperairan Desa Tiwatobi, selanjutnya sampel di preparasi di ruang pengolahan Teknologi Hasil Perikanan, Institut Keguruan dan Teknologi Larantuka. Sampel di ekstraksi dengan etanol 75% menggunakan métode maserasi. Sampel hasil ekstraksi di análisis sitotoksisitasnya dengan métode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Selanjutnya identifikasi senyawa aktif pada ekstrak etanol ikan buntal menggunakan GC-MS. Hasil penelitian menunjukan sitotoksisisitas ekstrak ikan buntal yang dinyatakan dengan nilai LC50 yaitu sebesar 49,479 ppm, yang masuk dalam kategori cukup toksik. Data hasil analisi senyaw menggunakan GC-MS ditemukan 10 senyawa aktif yang terdiri dari: Ethyl Acetate, Di-n-propyl ether, Propane, 1-ethoxy-2-methyl, Propanoic acid- ethyl ester, Disulfide- dimethyl, Dimethyl Sulfoxide, S-Methyl methanethiosulfinate, Cyclotetrasiloxane- octamethyl, S-Methyl methanethiosulphonate dan Cyclopentasiloxane, decamethyl-.