Resistensi antibiotik dianggap sebagai krisis dalam pengobatan modern. Selama 2 dekade terakhir, basil gram negatif penghasil Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) telah muncul sebagai masalah utama dalam berbagai situasi ini. ESBL didefinisikan sebagai enzim yang diproduksi oleh bakteri tertentu yang mampu menghidrolisis antibiotika golongan sefalosporin serta efektif melawan antibiotika betalaktam. Salah satu infeksi yang sering disebabkan oleh bakteri penghasil ESBL yaitu Infeksi Saluran Kemih (ISK). Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri penghasil ESBL pada pasien ISK serta mengetahui hasil Identification (ID) dan Antimicrobial Susceptibility (AST) pada sampel urin pasien ISK yang dirawat inap di Rumah Sakit Kartika Husada. Sampel urin diinokulasikan pada media ChromAgar, kemudian dilakukan uji ID dan AST menggunakan metode Phoenix BD. Hasil ID senyawa biokimia pada bakteri P. aeruginosa memetabolisme karbohidrat, protein, dan asam amino, pada K. pneumoniae memetabolisme karbohidrat, protein dan asam amino. Hasil pada uji AST menunjukkan bahwa kedua bakteri tersebut resisten terhadap beberapa antibiotik golongan penisilin dan sefalosforin generasi III, dan IV. Kesimpulan penelitian ini adalah terdapat bakteri penghasil ESBL pada sampel urin pasien ISK yang dirawat inap di Rumah Sakit Kartika Husada serta didapat hasil identifikasi dan karakterisasi berupa senyawa biokimia dan uji kepekaan antibiotik bakteri penghasil ESBL pada sampel urin pasien ISK yang dirawat di Rumah Sakit Kartika Husada.