Penggunaan pestisida di lingkup pertanian pada saat ini menjadi suatu peranan yang sangat penting. Penggunaan pestisida dengan indikasi yang tidak tepat dapat memicu keracunan. Menurunnya aktivitas enzim cholinesterase merupakan salah satu parameter untuk mengetahui terjadinya keracunan yang berasal dari pestisida. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui ada tidaknya suatu hubungan antara masa kerja dihadapkan dengan kadar enzim cholinesterase dalam darah seorang petani padi yang juga menjadi pengguna pestisida di Kelurahan Tirtorahayu Kabupaten Kulon Progo. Penelitian ini ialah penelitian dengan jenis berupa kuantitatif dan menggunakan pendekatan berupa Observasional analitik. Teknik pengambilan sampel dilaksanakan dengan cara purposive sampling dengan kriteria yang dilakukan pembagian menjaadi dua yakni inklusi dan eksklusi berjumlah 12 responden. Teknik pengumpulan data primer dilaksanakannya dengan melalui pengisian kuesioner tentang riwayat penggunaan pestisida dan menganalisa kadar pestisida dalam darah petani padi mempergunakan alat berupa Cobas integra 400 plus metode kinetik colorimetri DGKC. Data dianalisis mempergunakan metode analisis berupa statistik uji Spearman. Hasil dari cakupan penelitian memberi suatu petunjuk bahwa seluruh responden memiliki kadar enzim cholinesterase yang masih berada dalam range 5,32-12,92 kU/L dan sebagian besar dari yang menjadi responden memiliki masa kerja 5 tahun. Kesimpulan dari lingkup penelitian ini yaitu tidak adanya suatu hubungan antara dua hal yakni pertama masa kerja dengan hal kedua berupa kadar enzim cholinesterase dalam darah petani padi pengguna pestisida dengan nilai Sig angka dalam desimal dengan besaran 0,432 (p0,05).