Lalat rumah (Musca domestica) adalah lalat yang terdapat banyak di Indonesia dan sering dikenal sebagai vector penyakit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi ekstrak daun tembakau (Nicotina tabacum L.) yang efektif mematikan lalat rumah (Musca domestica), serta perlakuan (racun pernapasan dan racun perut) yang efektif membunuh lalat rumah (Musca domestica) Penelitian dilakukan di Laboratorium Pendidikan Biologi, Fakultas Ilmu Pendidikan Universitas Timor. Metode penelitian ini adalah jenis eksperimental dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 1 kelompok control tanpa perlakuan (control negative) dan 4 kelompok dengan perlakuan dan dilakukan ulangan sebanyak 3 kali, pada masing-masing ulangan berisi 10 ekor Musca domestica. Data yang diperoleh dilakukan uji analisisi regresi dengan menggunakan Microsoft excel untuk memperoleh nilai probit, dan juga digunakan aplikasi SPSS 22.0 dengan uji One-Way ANOVA untuk memperoleh nilai signifikan. Berdasarkan pengamatan dan analisis data diperoleh hasil untuk racun pernapasan dengan jumlah kematian Musca domestica paling tinggi yaitu 29 ekor pada konsentrasi 80%, sedangkan untuk racun perut dengan jumlah kematian paling tinggi yaitu 21 ekor pada konsentrasi 80%. Maka dapat disimpulkan bahwa racun pernapasan lebih banyak membunuh Musca domestica dibanding racun perut. Serta konsentrasi paling efektif membunuh yaitu konsentrasi 23% sebagai racun pernapasan. Houseflies (Musca domestica) are flies that are abundant in Indonesia and are often known as disease vectors. This study aims to determine the concentration of tobacco leaf extract (Nicotina tabacum L.) that is effective in killing houseflies (Musca domestica), as well as treatments (respiratory poison and stomach poison) that are effective in killing houseflies (Musca domestica). The study was conducted at the Biology Education Laboratory, Faculty of Education, Timor University. This research method is an experimental type using a completely randomized design (CRD) consisting of 1 control group without treatment (negative control) and 4 groups with treatment and repeated 3 times, each repetition containing 10 Musca domestica. The data obtained were subjected to regression analysis using Microsoft Excel to obtain probit values, and the SPSS 22.0 application was also used with the One-Way ANOVA test to obtain significant values. Based on observations and data analysis, the results for respiratory poison with the highest number of Musca domestica deaths were 29 at a concentration of 80%, while for stomach poison with the highest number of deaths were 21 at a concentration of 80%. So it can be concluded that respiratory poison kills more Musca domestica than stomach poison. And the most effective concentration to kill is 23% concentration as respiratory poison.