Semangka (Citrullus lanatus (Thunberg) Matsum & Nakai) merupakan komoditas buah bernilai ekonomi tinggi, terutama varietas tanpa biji. Salah satu strategi pemuliaannya adalah peningkatan ploidi untuk menghasilkan tetraploid sebagai induk semangka triploid. Penelitian ini bertujuan untuk untuk mengidentifikasi galur tetraploid stabil hasil poliploidisasi melalui analisis flow cytometry dan karakter morfologi. Penelitian dilakukan pada bulan September–Desember 2024 di Kota Batu, Jawa Timur untuk budidaya dan di PT. BISI Internasional Tbk, Kediri untuk analisis flow cytometry. Materi tanaman terdiri atas 24 galur semangka hasil perlakuan kolkisin generasi ke-7 hingga ke-9 serta 3 galur kontrol (2x, 3x, 4x). Analisis morfologi mencakup 19 karakter kuantitatif dan 14 karakter kualitatif berdasarkan deskriptor NARO. Data dianalisis menggunakan flow cytometry untuk mendeteksi tingkat ploidi, PCA untuk identifikasi karakter dominan, serta density plot untuk melihat distribusi pola morfologi. Hasil menunjukkan bahwa sembilan galur (LB5101, LB5103, LB5201, LB5203, LB5207, LB5208, LB5209, LB5212, dan LB5213) teridentifikasi sebagai tetraploid stabil (4x). Karakter morfologi dominan pada galur tetraploid stabil meliputi panjang daun, lebar daun, panjang tangkai daun, dan diameter tangkai daun. Karakter-karakter tersebut menunjukkan pola distribusi ke arah kanan yang sejalan dengan peningkatan tingkat ploidi.