Daun sirih hijau (Piper betle L.) dimanfaatkan dan dipercaya sebagai bahan obat alternatif dalam mengobati berbagai jenis penyakit. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun sirih hijau terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Escherichia coli serta mengidentifikasi golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak etanol daun sirih hijau. Ekstraksi daun sirih hijau (Piper betle L.) menggunakan pelarut etanol 96% dengan metode maserasi. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi disk, identifikasi golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dilakukan dengan uji bioautografi. Kadar ekstrak etanol yang digunakan adalah 2, 4, 6, dan 8 mg/disk. Kontrol positif menggunakan Erythromycin dan Ciprofloxacin serta pelarut DMSO 50% digunakan sebagai kontrol negatif. Hasil penelitian menunjukkan adanya aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun sirih hijau terhadap Staphylococcus epidermidis dengan seri konsentrasi 2 mg/disk, 4 mg/disk, 6 mg/disk, dan 8 mg/disk menghasilkan rata-rata zona hambat 9,5; 12; 15,12; dan 15,62 mm. Sedangkan hasil terhadap Escherichia coli dengan seri konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 mg/disk menghasilkan rata-rata zona hambat 10,25; 15,12; 15,87; dan 16,25 mm. Uji KLT memberikan hasil bahwa daun sirih hijau mengandung golongan senyawa fenol, saponin dan alkaloid. Hasil uji bioautografi menunjukkan bahwa senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis adalah golongan senyawa fenol pada Rf 0,8 dan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli adalah golongan senyawa alkaloid pada Rf 0,7.