Kontaminasi bakteri pada semen sapi merupakan salah satu faktor yang memengaruhi kualitas dan keberhasilan program inseminasi buatan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi jenis bakteri yang terdapat pada semen beku sapi simental dan efektivitas variasi antibiotik dengan perlakuan pengencer berbeda. Penelitian dilaksanakan melalui tiga tahap, yaitu koleksi semen segar dari delapan ekor sapi simental di Unit Pelaksana Teknis Daerah (UPTD) Balai Pengembangan Teknologi dan Sumber Daya (BPTSD) Tuah Sakato, Payakumbuh, Sumatra Barat. Pengenceran semen dilakukan dengan tiga perlakuan (P1= tanpa antibiotik; P2= antibiotik Penicillin-Streptomycin; P3= kombinasi Gentamisin, Tilosin, Lincomisin, Spektinomisin/GTLS), serta isolasi dan identifikasi bakteri pada semen cair dan semen beku di Laboratorium Bakteriologi, Balai Veteriner Bukittinggi, Sumatra Barat. Metode isolasi menggunakan media selektif dan identifikasi dilakukan melalui pewarnaan Gram, uji motilitas, katalase, oksidase, dan uji biokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari semen segar diisolasi 12 jenis bakteri, sedangkan dari semen beku diidentifikasi bakteri Alcaligenes spp., Chromobacterium spp., Corinebacterium spp., Klebsiella spp., Micrococcus spp., Alcaligenes spp., Haemophilus spp., Mycoplasma spp., Proteus spp., dan Serratia spp. Semen tanpa antibiotik (P1) memiliki tingkat kontaminasi bakteri tertinggi dengan lima jenis bakteri terdeteksi, sedangkan pada perlakuan P2 teridentifikasi tiga jenis bakteri dan P3 lima jenis bakteri namun dengan populasi lebih terkendali. Bakteri oportunistik seperti Klebsiella spp. dan Proteus spp. masih ditemukan meskipun menggunakan GTLS. Simpulannya, pada semen beku yang diencerkan dengan antibiotik masih ditemukan bakteri. Penambahan kombinasi antibiotik GTLS pada pengencer lebih efektif menekan pertumbuhan bakteri patogen dibandingkan Penicillin-Streptomycin, serta berpotensi meningkatkan mutu semen beku dan keberhasilan inseminasi buatan.