Penerapan hygiene sanitasi makanan di rumah makan masih menjadi tantangan di Indonesia, termasuk di Kota Padang. Berdasarkan data Dinas Kesehatan Kota Padang tahun 2023, hanya 73% cakupan tempat pengolahan makanan yang memenuhi syarat hygiene sanitasi di Kota Padang. Berdasarkan data Puskesmas Padang Pasir, pada Kelurahan Padang Pasir tempat pengolahan makanan yang memenuhi syarat hygiene sanitasi hanya 66,67%. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui faktor-faktor yang berhubungan dengan perilaku penjamah makanan dalam penerapan hygiene sanitasi makanan di rumah makan Kelurahan Padang Pasir tahun 2025. Penelitian ini merupakan studi kuantitatif dengan desain cross sectional. Penelitian dilakukan dari 13 s/d 19 Juni 2025 pada 21 rumah makan di Kelurahan Padang Pasir. Populasi pada penelitian ini adalah seluruh penjamah makanan di kelurahan Padang Pasir dan sampel sebanyak 52 penjamah makanan menggunakan teknik total sampling. Data dikumpulkan menggunakan kuisioner dan lembar observasi dan dianalisis menggunakan analisis univariat dan bivariat dengan uji chi square.Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 46,2% perilaku penjamah makanan kurang baik, 42,3% mempunyai tingkat pengetahuan rendah, 48,1% mempunyai sikap negatif, dan 40,4% memiliki pengawasan sanitasi yang kurang baik. Berdasarkan uji statistik menunjukkan terdapat hubungan antara tingkat pengetahuan (p=0,006) dan pengawasan (p=0,031) dengan perilaku penjamah makanan dalam penerapan hygiene sanitasi makanan. Serta tidak ada hubungan antara sikap (p=0,501) dengan perilaku penjamah makanan dalam penerapan hygiene sanitasi makanan tahun 2025.Terdapat hubungan antara tingkat pengetahuan dan pengawasan dengan perilaku penjamah makanan di rumah makan Kelurahan Padang Pasir tahun 2025. Diharapkan pihak puskesmas untuk melakukan penyuluhan dan pelatihan kepada seluruh penjamah makanan tentang penerapan hygiene sanitasi makanan yang baik.