Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi konsentrasi kitosan terhadap sifat fisik biofilm berbasis pati, pengaruh variasi gliserol sebagai plasticizer terhadap fleksibilitas dan kelarutan biofilm, perbandingan karakteristik biofilm dari berbagai kombinasi kitosan–gliserol, dan mengetahui formula mana yang memberikan sifat biofilm paling optimal untuk kemasan pangan ramah lingkungan. Penelitian ini meliputi pembuatan larutan pati, pembuatan larutan kitosan, pencampuran larutan pati, kitosan, dan gliserol, pembuatan biofilm, pengujian ketabalan film, kelarutan dalam air, daya serap air, serta kekuatan tarik. Penggunaan plastik konvensional sebagai kemasan pangan menimbulkan permasalahan lingkungan karena sifatnya yang sulit terdegradasi secara alami. Oleh karena itu, diperlukan alternatif kemasan yang ramah lingkungan dan biodegradable, salah satunya melalui pengembangan biofilm edible berbasis biopolimer alami. Hasil pengujian menunjukkan bahwa variasi konsentrasi kitosan dan gliserol berpengaruh signifikan terhadap seluruh karakteristik biofilm. Ketebalan biofilm meningkat seiring bertambahnya konsentrasi kitosan dan gliserol, dengan nilai berkisar antara 45–130 µm. Nilai kelarutan dan daya serap air meningkat pada formulasi dengan gliserol tinggi, sedangkan penambahan kitosan mampu menurunkan kelarutan dan daya serap air biofilm. Kekuatan tarik biofilm meningkat seiring bertambahnya konsentrasi kitosan, dengan nilai tertinggi mencapai 14,5 MPa. Namun, pada konsentrasi tinggi biofilm menjadi kaku dan kurang elastis. Formulasi terbaik diperoleh pada sampel A04 karena memiliki keseimbangan optimal antara ketebalan, kekuatan tarik, fleksibilitas, serta stabilitas terhadap air. Berdasarkan hasil tersebut, biofilm edible berbasis pati–kitosan–gliserol memiliki potensi sebagai alternatif kemasan pangan biodegradable yang ramah lingkungan dan dapat mengurangi penggunaan plastik sintetis.