Buah belimbing wuluh memiliki kandungan senyawa pada yaitu flavonoid, tanin, saponin, steroid/triterpenoid dan alkaloid yang berfungsi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antibakteri fraksi n-heksan, etil asetat dan air dari ekstrak etanol buah belimbing wuluh terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923; mengetahui fraksi teraktif dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari buah belimbing wuluh terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923. Buah belimbing wuluh diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 96%. Fraksinasi dari ekstrak buah belimbing wuluh dengan pelarut n-heksan, etil asetat dan air. Uji aktivitas antibakteri ekstrak dan fraksi dari ekstrak etanol buah belimbing wuluh terhadap Staphylococcus aureus dilakukan dengan metode difusi pada konsentrasi 20%, 10%, dan 5%, sedangkan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari fraksi teraktif dengan metode dilusi pada konsentrasi 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,12%; 1,56%; 0,78%; 0,39%. Data diameter zona hambat yang diperoleh dari hasil uji difusi dianalisis statistik menggunakan metode one way ANOVA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak dan fraksi buah belimbing wuluh memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Fraksi etil asetat buah belimbing wuluh dengan konsentrasi 20% memiliki aktivitas antibakteri teraktif dengan rata- rata diameter zona hambat sebesar 26,32 mm. Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) fraksi etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 sebesar 12,5%.