Sarang semut adalah tanaman epifit yang secara empiris sering dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai tanaman obat untuk mengobati penyakit seperti nyeri dan demam. Studi literatur menyatakan bahwa ekstrak air sarang semut mengandung senyawa bioaktif flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agen biologis untuk pengobatan kanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid pada ekstrak air sarang semut serta mengevaluasi aktivitas antiproliferasinya terhadap sel line A549. Identifikasi awal senyawa flavonoid dilakukan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan konfirmasi golongan senyawa dilakukan menggunakan pereaksi geser UV-Vis. Identifikasi kandidat senyawa secara lebih spesifik dilakukan menggunakan Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS). Hasil analisis KLT menunjukkan adanya bercak dominan dengan nilai Rf sekitar 0,38 yang mengindikasikan keberadaan senyawa golongan flavonoid. Analisis LC-HRMS menunjukkan adanya beberapa kandidat senyawa flavonoid, di antaranya epigallocatechin, epicatechin, daidzein, quercetin, taxifolin,5,4'-dihydroxy-3,3'-dimethoxy-6,7-ethylenedioxyflavone. Hasil MTT assay menunjukkan bahwa ekstrak air sarang semut memiliki aktivitas antiproliferasi terhadap sel A549 secara dose-dependent, dengan persentase inhibisi tertinggi sebesar 65,60% pada konsentrasi 1000 ppm, sedangkan konsentrasi 125 ppm telah menghasilkan inhibisi sebesar 50,89%. Perhitungan nilai IC50 menggunakan metode interpolasi linear menunjukkan nilai sebesar 120,9 ppm. Berdasarkan hasil tersebut, ekstrak air sarang semut berpotensi sebagai sumber senyawa bioaktif dengan aktivitas antiproliferasi terhadap sel kanker paru A549.