Limbah Rumah Sakit di Indonesia, khususnya limbah medis yang infeksius, belum dikelola dengan baik.Pemilahan yang baik akan didukung oleh perilaku petugas dalam penanganan sampah medis. Perilakupenanganan sampah yang tidak baik akan berakibat terhadap munculnya infeksi nosokomial. Ada beberapafaktor yang berhubungan dengan perilaku tenaga kesehatan dalam pemilahan sampah medis yaitu umur,pendidikan pekerjaan, pengetahuan, sikap dan masa kerja. Tujuan penelitian ini untuk mengetahuihubungan masa kerja dengan perilaku pemilahan limbah medis pada tenaga kesehatan di Rumah Sakit PMIKota Bogor. Jenis penelitian yang digunakan deskriptif analitik dengan pendekatan cross sectional.Pengambilan sampel dengan teknik accidental sampling sebanyak 35 perawat di Rumah Sakit PMI KotaBogor. Pengumpulan data ini menggunakan kuisioner. Analisa data yang digunakan yaitu analisa univariatdalam bentuk distribusi frekuensi pada karakteristik tiap variabel yang diteliti, dan analisa bivariatmenggunakan uji cramer v test. Hasil penelitian menunjukkan dari 35 responden didapatkan sebanyak 23responden (65,7%) dengan masa kerja yang lama (> 5 tahun) dan sebanyak 18 responden (51,4%) denganperilaku pemilahan limbah medis negatif. Hasil uji statistik didapatkan nilai p value 0,005 < 0,05 maka Haditerima dan Ho ditolak. Nilai Odds Ratio sebesar 0,655 dengan 95% CI pada 0,160 – 2,680 menunjukkannilai OR kurang dari 1 dan 95% CI minimal di bawah 1, dapat diartikan bahwa faktor masa kerja yang lama(> 5 tahun) cenderung 2,680 (1/0,655) kali mengakibatkan perilaku pemilahan sampah medis positif.Ada hubungan masa kerja dengan perilaku pemilahan limbah medis pada tenaga kesehatan di Rumah SakitPMI Kota Bogor. Disarankan untuk dijadikan bahan evaluasi penilaian pelaksanaan pemilahan sampahmedis melalui kegiatan pelatihan tentang pentingnya pemilahan limbah medis bagi tenaga kesehatan.