Yoghurt labu kuning merupakan produk pangan fungsional inovatif yang menggabungkan manfaat probiotik dari fermentasi susu dengan kandungan nutrisi tinggi labu kuning (Cucurbita moschata), termasuk beta-karoten, vitamin C, serta antioksidan. Lama fermentasi merupakan faktor kritis yang menentukan mutu akhir yoghurt, karena berpengaruh langsung terhadap aktivitas bakteri asam laktat (BAL), pembentukan asam laktat, serta karakteristik fisik dan sensoris produk. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama fermentasi terhadap sifat fisik (kadar asam laktat dan pH) dan sifat organoleptik (warna, aroma, rasa, dan tekstur) yoghurt labu kuning. Metode yang digunakan adalah eksperimental dengan tiga perlakuan variasi lama fermentasi, yaitu 6 jam (P1), 12 jam (P2), dan 24 jam (P3), menggunakan filtrat labu kuning sebanyak 8% dan starter bakteri Lactobacillus bulgaricus serta Streptococcus thermophilus masing-masing 2%. Uji organoleptik dilakukan oleh 25 panelis menggunakan skala hedonik 1–5, sedangkan kadar asam laktat diukur dengan metode titrasi dan pH diukur menggunakan pH meter. Hasil penelitian menunjukkan bahwa lama fermentasi berpengaruh nyata terhadap seluruh parameter yang diuji. Kadar asam laktat meningkat seiring bertambahnya lama fermentasi, yaitu 0,41% (6 jam), 0,51% (12 jam), dan 0,74% (24 jam), dengan pH berturut-turut 5, 4, dan 3. Fermentasi selama 12 jam menghasilkan yoghurt dengan kualitas terbaik berdasarkan uji organoleptik warna (̅x = 3,68), aroma (̅x = 3,80), rasa (̅x = 3,76), dan tekstur (̅x = 3,72), serta kadar asam laktat dan pH yang memenuhi standar mutu yoghurt SNI 2981:2009 (kadar asam 0,5–2,0%, pH 3,8–4,6). Disimpulkan bahwa 12 jam merupakan waktu fermentasi optimal dalam pembuatan yoghurt labu kuning untuk menghasilkan produk bermutu tinggi yang dapat diterima konsumen.