Sargassum polycystum merupakan jenis rumput laut coklat yang sangat berpotensi untuk dimanfaatkan karena mengandung senyawa flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan dan mempunyai bioaktivitas sebagai obat. Analisis kadar flavonoid total dalam Sargassum polycystum perlu dilakukan untuk menjamin kualitas serta keamanan suatu bahan obat. Salah satu faktor yang berpengaruh terhadap perolehan kadar flavonoid total adalah konsentrasi pelarut sehingga dalam penelitian ini digunakan pelarut etanol 50%, 70% dan 96% yang bertujuan untuk mengetahui konsentrasi pelarut etanol yang paling optimal dalam mendapatkan kadar flavonoid total Sargassum polycystum menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis dengan pembanding kuersetin. Metode tersebut perlu di validasi yang terdiri dari selektivitas, linearitas, presisi dan akurasi. Hasil selektivitas didapatkan λmaks yaitu 435,50 nm. Hasil linearitas diperoleh persamaan y=0,0763x-0,0790 dengan nilai r= 0,9936. Hasil presisi diperoleh % RSD yaitu 0,998% dan hasil % Recovery ekstrak etanol 50% adalah 100,4856%; ekstrak etanol 70% adalah 77,2643% dan ekstrak etanol 96% adalah 83,5053%. Kadar flavonoid total yang diperoleh untuk ekstrak etanol 50%, 70% dan 96% berturut-turut adalah 0,0539%b/b, 01300%b/b dan 0,1180%b/b sehingga dapat disimpulkan bahwa kadar flavonoid total tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 70%. Berdasarkan uji Kruskall Wallis diperoleh nilai signifikansi 0,027 (P<0,05) artinya terdapat pengaruh konsentrasi pelarut etanol terhadap kadar flavonoid total yang diperoleh.