Infeksi akibat Staphylococcus aureus merupakan masalah kesehatan yang sering terjadi dan mebutuhkan alternatif pengobatan dari bahan alam. Daun pepaya (Carica papaya L.) diketahui mengandung senyawa aktif seperti flavonoid, saponin, alkaloid, dan tanin yang berpotensi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ativitas antibakteri ekstrak etanol daun pepaya terhadap Staphylococcus aureus melalui penentuan Kadar Hambuat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi STIKes Maluku Husada pada tahun 2025. Sampel daun pepaya segar diperoleh dari desa Tulehu, Kabupaten Maluku Tengah, diolah menjadi simplisia, kemudian diekstraksi dengan metode maserasi menguunakan etanol 70%. Hasil ekstraksi menghasilkan rendamen sebesar 10,75%. Uji fitokimia menunjukan bahwa ekstrak mengandung alkaloid, tanin, saponin, dan flavonoid. Uji KHM dilakukan menggunakan metode dilusi cair dengan variasi konsentrasi 5%, 10%, 15%, dan 20%, sedangkan uji KBM dilakukan menggunakan metode sebar pada media Nutrien Agar. Hasil menunjukan bahwa KHM diperoleh pada konsentrasi 10%, ditandai dengan kejernihan media dan tidak adanya pertumbuhan bakteri. Namun, pada uji KBM tidak ditemukan aktivitas bakteriosidal karena koloni bakteri masih tumbuh pada seluruh konsentrasi. Hasil ini menunjukan bhawa ekstrak daun pepaya memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus namun belum mampu membunuhnya secara menyeluruh. Dengan demikian, ekstrak daun pepaya berpotensi dikembangkan sebagai agen antibakteri alami, namu diperlukan penelitian lanjutan untuk optimasi konsentrasi dan efektivitasnya.