Roti merupakan salah satu produk makanan cepat saji karena sangat mudah didapatkan dan sebagai salah satu bahan makanan pokok yang dikonsumsi secara global. Namun, roti mudah mengalami kerusakan yang dapat disebabkan oleh bakteri dan jamur yang mempengaruhi kesehatan. Penelitian ini bertujuan unutk mengidentifikasi cemaran atau kontaminan bakteri dan jamur pada produk roti. Sampel roti diperoleh dari beberapa kantin sekolah, warung, dan pasar yang berada di Kota Yogyakarta. Dalam mengidentifikasi bakteri dibutuhkan medium Nutrient Agar, Mannitol Salt Agar, dan Baird Parker Agar, sedangkan jamur ditumbuhkan pada medium Malts Extract Agar pada cawan petri. Seleksi koloni bakteri menjadi koloni tunggal dilakukan dengan uji biokimia. Uji konfirmasi bakteri dilakukan dengan API Staph dan uji molukuler dengan gen penanda nuc dan sea menggunakan PCR. Isolat jamur diidentifikasi secara makromorfologi melalui pengamatan bentuk koloni dan mikromorfologi melalui pengamatan sel dengan teknik slide culture. Jenis bakteri yang ditemukan pada sampel yaitu Staphylococcus aureus (teridentifikasi API 52,8%, 97,7%, dan 97,7%). Isolat terduga S. aureus dengan persentase ID 52,8% terdeteksi memiliki gen sea tetapi tidak memiliki gen nuc. Isolat terduga. Jenis jamur yang ditemukan pada sampel yaitu Aspergillus niger.