Infeksi saluran pernapasan akut (ISPA) diklasifikasikan menjadi infeksi saluran pernapasan atas dan bawah. Infeksi saluran pernapasan atas dan bawah merupakan penyakit yang umum terjadi di masyarakat. Infeksi ini disebabkan oleh masuknya mikroorganisme berupa bakteri yang belum diketahui sebagai penyebab infeksi yang kemudian dapat berkembang menjadi infeksi yang disebabkan oleh bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Adanya bakteri penyebab ISPA diperlukan uji diagnostik menggunakan sputum. Bervariasinya mengenai bakteri yang ditemukan pada sputum, maka digunakan sampel sputum yang merupakan sampel representatif untuk mengetahui penyebab infeksi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan spesies bakteri Gram-negatif dari sputum penderita ISPA di Rumah Sakit Dustira Kota Cimahi. Metode penelitian ini menggunakan metode deskriptif melalui penelitian kultur sputum yang di tanam pada media MacConkey Agar (MCA), pewarnaan Gram mikroskopis dan uji biokimia metode IMVIC penderita ISPA periode Februari-Maret 2017. Hasil penelitian menunjukkan ditemukan bakteri Gram negatif dari 15 sampel sputum penderita ISPA terdapat spesies bakteri dengan persentase Klebsiella pneumoniae 13,3 %,Pseudomonas aeruginosa 26,6 %Enterobacter aerogenes 13,3%,danProteus mirabilis 13,3 %. Disarankan penegakkan diagnosis lebih diperhatikan agar lebih akurat mengenai salah satu penyebab infeksi dan para klinisi dapat menentukan terapi antibiontik selanjutnya agar pengobatan pada pasien lebih efektif dan efisien. Kata kunci :Infeksi saluran pernapasan akut, sputum, bakteri Gram negatif.