Perilaku hygiene penjamah makanan merupakan prosedur menjaga kebersihan dalam pengelolaan makanan yang aman dan sehat. Perilaku hygiene penjamah makanan sangat penting dalam proses pengolahan makanan karena dapat meminimalisir kemungkinan terjadinya kontaminasi pada makanan. Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi perilaku hygiene penjamah makanan salah satunya pendidikan, pengetahuan dan lama kerja. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan pendidikan, pengetahuan dan lama kerja dengan perilaku hygiene penjamah makanan di PPMI Assalaam Sukoharjo. Metode penelitian ini adalah observasional analitik dengan pendekatan cross sectional. Teknik pengambilan sampel dengan sampling jenuh dengan jumlah 30 sampel. Pengumpulan data pendidikan, pengetahuan dan lama kerja menggunakan kuesioner, sedangkan data perilaku hygiene diperoleh menggunakan lembar observasi chek list, wawancara dan pengamatan sebanyak 3 kali pengamatan. Analisis statistik menggunakan uji korelasi Rank Spearman. Berdasarkan hasil penelitian diketahui sebagian besar pendidikan sampel dalam kategori pendidikan menengah sebanyak 19 (63,3%), pengetahuan dalam kategori cukup sebanyak 18 (60%), lama kerja dalam kategori lama sebanyak 20 (66,7%), dan perilaku hygiene dalam kategori cukup sebanyak 19 (63,3%). Hasil uji hubungan antara pendidikan dengan perilaku hygiene (p=0,038), pengetahuan dengan perilaku hygiene (p=0,141), dan lama kerja dengan perilaku hygiene (p=0,258). Kesimpulan penelitian ini ada hubungan pendidikan dengan perilaku hygiene penjamah makanan di PPMI Assalaam Sukoharjo dan tidak ada hubungan antara pengetahuan dan lama kerja dengan perilaku hygiene penjamah makanan di PPMI Assalaam Sukoharjo.