Tenaga kesehatan yang bekerja di rumah sakit memiliki risiko tertinggi untuk terpajan dan terinfeksi oleh virus SARS-CoV-2 selama pandemi COVID-19. Hal ini tercermin dari jumlah tenaga kesehatan yang terinfeksi. Oleh karena itu, dibutuhkan perilaku pencegahan infeksi yang baik ketika bekerja, termasuk dalam hal pengetahuan dan sikap. Studi ini bertujuan mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi perilaku pencegahan infeksi oleh tenaga kesehatan (nakes) ketika bekerja dan membandingkan pengetahuan, sikap dan perilaku pencegahan infeksi antara nakes di ruang rawat inap kelas III dan ruang isolasi COVID-19 di Rumah Sakit (RS) Universitas Royal Prima Indonesia. Studi cross-sectional komparatif dengan total sampling dilakukan pada 30 nakes dan 40 nakes ruang isolasi COVID-19. Data diperoleh melalui kuesioner yang diberikan melalui Google form dan data sekunder dari manajemen RS. Uji korelasi Spearman dan Mann-Whitney U digunakan untuk analisis statistik. Hasil studi menunjukkan terdapat hubungan signifikan antara perilaku terhadap COVID-19 dengan kualitas alat pelindung diri (APD) (r = 0,698) dan pelatihan APD (r = 0,698) pada nakes di ruang inap isolasi. Terdapat perbedaan perilaku (p = 0,22) dan pengetahuan (p = 0,00) terhadap COVID-19 antara nakes ruang inap kelas III dengan nakes ruang inap isolasi. Kesimpulan perilaku dan pengetahuan nakes ruang isolasi COVID-19 berbeda dengan nakes di ruang rawat inap kelas. Perilaku nakes di ruang isolasi COVID-19 berhubungan dengan kualitas dan pelatihan penggunaan APD. Disarankan terdapat monitoring ketersediaan APD berkualitas dan pelatihan penggunaan APD untuk meningkatkan perilaku pencegahan infeksi.