Pemeriksaan kesehatan berkala bagi pegawai bukan hanya kewajiban, tetapi juga investasi dalam kesejahteraan dan produktivitas. Tujuan penelitian ini adalah menjelaskan perbedaan pengetahuan, sikap dan motivasi dalam pemeriksaan kesehatan berkala pegawai BPJS Kesehatan Cabang Kupang. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan desain randomized pretest posttest control group design. Jumlah sampel sebanyak 30 dengan rincian 15 sampel perlakuan dan 15 sampel kontrol. Analisis data menggunakan uji Wilcoxon dan uji Mann Whitnney. Hasil penelitian menunjukkan bahwa, Ada perbedaan pengetahuan, sikap, dan motivasi dalam pemeriksaan kesehatan berkala sebelum dan sesudah perlakuan promosi kesehatan dengan p value < 0,05, Ada perbedaan pengetahuan dalam pemeriksaan kesehatan berkala pegawai antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol sesudah promosi kesehatan dengan nilai p value 0,033<0,05, Ada perbedaan sikap dalam pemeriksaan kesehatan berkala pegawai antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol sesudah promosi kesehatan dengan nilai p value 0,012<0,05, Ada perbedaan motivasi dalam pemeriksaan kesehatan berkala pegawai antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol sesudah promosi kesehatan dengan nilai p value 0,003<0,05. Penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh BPJS Kesehatan untuk membuat kebijakan terkait pemeriksaan kesehatan berkala dan merancang media peningkatan pengetahuan, sikap dan motivasi pegawai yang sesuai bagi pegawai agar melakukan pemeriksaan kesehatan berkala.