Pencegahan penularan infeksi mycobacterium tuberculosis adalah upaya yang sangat penting dalam peningkatan kesehatan dan menurunkan angka kejadian TB paru. Kejadian kasus penyakit tuberkulosis sangat terkait dengan faktor internal penderita, perilaku maupun lingkungan. Untuk mengurangi penularan TB paru, harus diimbangi dengan perilaku yang baik oleh penderita TB paru, keluarga maupun masyarakat. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi dan menganalisa karakteristik dan perilaku penderita tuberkulosis paru dalam praktik pencegahan penularan penyakit tuberkulosis paru. Penelitian ini menggunakan jenis penelitian kuantitatif dengan desain dengan metode deskriptif yang dilaksanakan dari tanggal 28 Maret sampai 31 Juli 2024. Populasi dalam penelitian adalah semua penderita tuberkulosis paru yang berada di Wilayah Kerja Puskesmas Onekore Kabupaten Ende. Pengambilan sampel dilakukan secara accidental sampling dengan jumlah sampel 50 responden. Hasil penelitian menunjukkan karakteristik penderita tuberkulosis paru di wilayah kerja Puskesmas Onekore Ende Kabupaten Ende berdasarkan umur terbanyak berusia 31-60 tahun yaitu (50%), berjenis kelamin laki-laki (62%), tingkat pendidikan pendidikan SLTA/sederajat (54%), jenis pekerjaan sebagai pegawai swasta (42%), status pernikahan dengan status nikah (54 %), dan status ekonomi dengan status rendah (78 %). Terdapat hubungan yang signifikan antara pengetahuan (p = 0,043) dan perilaku (p = 0,011) dengan praktik pencegahan tuberculosis paru di wilayah kerja Puskesmas Onekore Kabupaten Ende. Kesimpulannya pentingnya memberikan informasi dan edukasi secara rutin dan optimal serta bekerja sama dengan kader kesehatan sebagai upaya pencegahan tuberkulosis paru demi memperkaya pengetahuan dan keterampilan dalam pencegahan penyakit tuberkulosis sehingga dapat menekan dan mencegah penularan penyakit bagi masyarakat.