Media selektif Edamame Agar dengan penambahan Polymyxin B dibuat bertahap yaitu pembuatan tepung edamame dan pembuatan edamame agar + Polymyxin B. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni – September 2023, bertempat di Laboratorium Analisis Pangan Politeknik Negeri Jember. Penelitian bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri Bacillus Subtillis pada edamame agar dengan penambahan Polymyxin B dan membuat SOP. Metode penelitian dengan membandingkan pertumbuhan bakteri Bacillus Subtilis pada edamame agar dengan media Mannitol Egg yolk polymyxin Agar .Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah koloni bakteri Bacillus subtillis pada media dengan penambahan Polymyxin B 0,6 % , 1,1 %, 1,6 % dan media Mannitol Egg yolk polymyxin Agar dengan masa inkubasi 48 jam adalah 3,9 x 105, 2,2 x 105, 1,0 x 105 cfu/ml dan pada Mannitol Egg yolk polymyxin Agar 3,5 x 105 cfu/ml . Pengujian kimia terhadap koloni yang tumbuh pada keempat media menunjukkan hasil sama yaitu Katalase positip, Fermentasi Laktosa negatip , Fermentasi Glukosa positif dan Voges Proskauer positip. Pengecatan gram menunjukkan bakteri Bacilus subtilis yang tumbuh pada media Edamame agar dan Mannitol Egg yolk polymyxin Agar diperoleh hasil bentuknya batang dan berwarna biru yaitu termasuk bakteri gram positip.Kesimpulan penelitian adalah media edamame agar dengan penambahan Polymyxin B mampu menghambat bakteri gram negatip dan menumbuhkan bakteri gram positip Bacillus subtillis secara optimal . Bakteri Bacillus subtillis yang tumbuh terbanyak pada media edamame agar dengan penambahan Polymyxin B 0,6% dengan TPC 3,9 x 105 cfu/ml lebih tinggi dibandingkan dengan Mannitol Egg yolk polymyxin Agar dengan TPC 3,5 x 105 cfu/ml.