Infertility is one of the main health problems in Indonesia experienced by women with a percentage of 20-35%. One of the supporting therapies for infertility is the use of medicinal plants. One part of the plant that has many benefits in herbal medicine is pumpkin seeds (Cucurbita moschata). Pumpkin seeds contain flavonoid compounds, namely phytoestrogen isoflavones, which have similar properties to estrogen in the body. The purpose of this study was to analyze the total flavonoid content of pumpkin seeds as an initial stage in their activity as a fertility agent in women. The extraction method used was maceration using 96% ethanol, then the evaporation process was carried out, and the final stage was fractionation using ethyl acetate and n-hexane. Quantitative flavonoid tests were carried out on the n-hexane fraction using the UV-Vis spectrophotometry method. The results of the qualitative test of the n-hexane fraction of pumpkin seed extract were positive for flavonoids. Quantitative tests of the n-hexane fraction of pumpkin seed extract with 3 replications obtained total flavonoid levels, respectively, were 27.77; 27.15; and 27.36 mgQE/g. Pumpkin seeds contain non-polar flavonoids. The n-hexane fraction of pumpkin seed extract contains flavonoids with an average total flavonoid content of 27.43±0.32 mgQE/g. ABSTRAK Infertilitas merupakan salah satu permasalahan kesehatan utama di Indonesia yang dialami oleh wanita dengan persentase 20-35%. Salah satu terapi penunjang pada infertilitas dengan pemanfaatan tumbuhan yang berkhasiat obat. Salah satu bagian tumbuhan yang memiliki banyak manfaat dalam pengobatan herbal adalah biji labu kuning (Cucurbita moschata). Biji labu kuning mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu isoflavon fitoestrogen yang memiliki kemiripan sifat dengan estrogen di dalam tubuh. Tujuan dari penelitian ini untuk menganalisis kadar total flavonoid biji labu kuning sebagai tahapan awal dalam aktivitasnya sebagai agen fertilitas pada wanita. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi menggunakan etanol 96%, kemudian dilakukan proses evaporasi, dan tahapan akhir dilakukan fraksinasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksan. Uji kuantitatif flavonoid dilakukan pada fraksi n-heksan menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Hasil uji kualitatif fraksi n-heksan ekstrak biji labu kuning adalah positif mengandung flavonoid. Uji kuantitatif fraksi n-heksan ekstrak biji labu kuning dengan 3 kali replikasi didapatkan kadar flavonoid total berturut-turut adalah 27,77; 27,15; dan 27,36 mgQE/g. Biji labu kuning memiliki kandungan flavonoid non polar. Fraksi n-heksan ekstrak biji labu kuning mengandung flavonoid dengan kadar flavonoid total rata-rata 27,43±0,32 mgQE/g.