Adanya pigmen karoten pada labu kuning dapat menjadikan tepung memiliki warna yang menarik. Akan tetapi, tingginya kandungan serat kasar dalam labu kuning dapat menyebabkan rendahnya nilai kecernaan, yang berdampak pada penyerapan zat gizi. Untuk mengatasi permasalahan tersebut perlu adanya teknologi fermentasi. Proses fermentasi dapat meningkatkan nilai nutrisi produk dengan penurunan senyawa antinutrisi, meningkatkan daya cerna dan ketersediaan makronutrisi. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis karakteristik warna, karoten, serat kasar, kadar air, karbohidrat dan protein tepung labu kuning dengan variasi lama waktu fermentasi Saccharomyces cerevisiae; serta menentukan lama waktu fermentasi terbaik dalam pembuatan tepung labu kuning. Penelitian menggunakan metode rancangan acak kelompok satu faktor yaitu lama waktu fermentasi. Terdapat 6 perlakuan (0, 1, 2, 3, 4, dan 5 hari) dengan 4 kali pengulangan. Parameter yang dianalisis meliputi warna, karoten, serat kasar, kadar air, karbohidrat dan protein. Hasil penelitian menunjukkan bahwa lama waktu fermentasi meningkatkan kecerahan warna, warna kekuningan, kadar karoten dan karbohidrat; namun menurunkan warna kemerahan, serat kasar, kadar air dan protein tepung labu kuning. Lama waktu fermentasi terbaik dalam pembuatan tepung labu kuning adalah 3 hari. Tepung labu kuning terfermentasi 3 hari berpotensi sebagai tepung dengan warna menarik, tinggi akan kandungan karoten, protein dan karbohidrat, rendah serat dan kadar air sehingga memudahkan dalam proses penyerapan zat gizi dan memiliki umur simpan panjang.