Singkong (Manihot esculenta Crantz) merupakan makanan pokok penting bagi sekitar 800 juta orang, terutama di wilayah tropis, dengan peningkatan produksi global sekitar 100 juta ton sejak tahun 2000. Di Indonesia, konsumsi singkong yang meningkat turut menghasilkan limbah kulit singkong, yang umumnya dibuang atau digunakan sebagai pakan ternak bernilai ekonomi rendah. Pembuangan yang tidak dikelola dengan baik dapat menyebabkan pencemaran lingkungan dan emisi gas metana. Kulit singkong, dengan kandungan pati mencapai 36%, memiliki potensi sebagai media alternatif pertumbuhan mikroorganisme yang lebih murah dibandingkan media komersial seperti Potato Dextrose Agar (PDA). Penelitian ini bertujuan untuk memanfaatkan limbah kulit singkong sebagai media pertumbuhan Rhizopus oligosporus Saito, jamur yang digunakan dalam fermentasi pangan dan mampu menghasilkan metabolit sekunder bernilai tinggi. Maka dibutuhkan pengembangan media alternatif yang efisien dan ramah lingkungan untuk pertumbuhan mikroba. Metode penelitian meliputi karakterisasi R. oligosprus Saito, persiapan inokulum, pembuatan bubuk pati kulit singkong, serta optimasi konsentrasi pati kulit singkong, glukosa, dan pH media menggunakan fermentasi substrat cair (SmF). Hasil menunjukkan bahwa R. oligosprus Saito dapat tumbuh pada media alternatif berbasis kulit singkong dengan kondisi optimum pada 40 g/L pati kulit singkong, 10 g/L glukosa, dan pH 6 – 6.5. Penelitian ini menunjukkan potensi kulit singkong sebagai sumber karbon yang ekonomis dan ramah lingkungan, sekaligus mendukung pengembangan produk bioteknologi berbasis limbah organik.