Latar Belakang. Infeksi Human Immunodeficiency Virus (HIV) masih menjadi tantangan kesehatan global, termasuk di Indonesia. Pemeriksaan HIV pada ibu hamil merupakan langkah penting dalam mencegah penularan dari ibu ke anak. Human Immunodeficiency Virus (HIV) adalah penyakit yang bekerja dengan cara merusak system imun tubuh sehingga penderita mudah terserang penyakit infeksi oportunistik bila jumlah CD4 (sel darah putih atau limphocyte/Sel-T) menurun atau kadar viral loadnya meningkat. Tujuan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan antara pengetahuan ibu hamil tentang HIV dengan pelaksanaan pemeriksaan HIV di Puskesmas Waingapu tahun 2024. Metode: Penelitian ini menggunakan desain kuantitatif dengan pendekatan cross-sectional. Sampel terdiri dari ibu hamil yang melakukan kunjungan ke Puskesmas Waingapu Maret-April tahun 2024. Pengumpulan data dilakukan melalui kuesioner yang mengukur tingkat pengetahuan tentang HIV serta riwayat pemeriksaan HIV selama kehamilan. Analisis data menggunakan uji chi-square untuk mengetahui hubungan antara dua variabel. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara pengetahuan ibu hamil dan informasi tentang HIV dengan pelaksanaan pemeriksaan HIV. Ibu yang pernah mendengar tentang HIV lebih cenderung melakukan pemeriksaan (69,23%) dibandingkan dengan yang belum pernah mendengar (25,53%), dengan nilai p = 0,000. Temuan ini menunjukkan bahwa akses terhadap informasi memiliki peran penting dalam mendorong tindakan pencegahan. Selain itu, tingkat pengetahuan juga berpengaruh signifikan (p = 0,007), di mana ibu dengan pengetahuan tinggi menunjukkan angka pemeriksaan yang jauh lebih tinggi (68,62%) dibandingkan ibu dengan pengetahuan rendah (23,8%). Simpulan: Pengetahuan dan paparan informasi terkait HIV merupakan faktor yang secara signifikan berkontribusi terhadap keputusan ibu hamil untuk melakukan pemeriksaan HIV. Intervensi edukatif dan promosi kesehatan menjadi kunci penting untuk meningkatkan partisipasi dalam pemeriksaan ini. Saran: Diharapkan pihak Puskesmas dan tenaga kesehatan dapat meningkatkan kegiatan penyuluhan dan konseling untuk mendorong ibu hamil melakukan pemeriksaan HIV secara rutin.