Infeksi menjadi salah satu masalah kesehatan yang paling umum ditemui. Infeksi disebabkan oleh mikroorganisme yang masuk kedalam tubuh seperti bakteri Staphylococcus aureus. Pengobatan infeksi dapat dilakukan dengan menggunakan antibiotik, namun penggunaan antibiotik dapat menyebabkan resisten. Maka diperlukan alternatif pengobatan dengan menggunakan bahan alami seperti daun salam (Syzygium polyanthum) yang dibuat dalam sediaan salep. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri sediaan salep ekstrak daun salam tehadap bakteri Staphylococcus aureus. Jenis penelitian ini adalah eksperimental dengan menggunakan metode difusi cakram. Hasil uji mutu fisik dari ketiga formulasi menunjukkan bahwa pada uji organoleptis, uji daya lekat, uji daya sebar, uji daya proteksi dan uji pH sudah memenuhi standar sediaan salep, tetapi pada uji homogenitas didapatkan hasil bahwa ketiga formulasi tidak homogen. Hasil penelitian aktivitas antibakteri pada sediaan salep ekstrak daun salam konsentrasi 30% sebesar 3,30 mm yang diketegorikan lemah, konsentrasi 45% sebesar 4,10 mm yang dikategorikan lemah dan konsentrasi 60% sebesar 4,95 mm juga dikategorikan lemah. Hasil uji statistik yaitu Kruskall-Wallis didapatkan nilai sig.<0,05 yang berarti terdapat perbedaan antara kelompok uji. Uji lanjutan dilakukan dengan menggunakan uji Dunn’s test dan didapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kontrol negatif dengan kontrol positif dan formulasi 3, sedangkan kontrol positif berbeda nyata dengan formulasi 3. Ketiga formulasi sediaan salep ekstrak daun salam mempunyai mutu fisik yang memenuhi standar sediaan salep dan mempunyai potensi dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus.