Sargassum sp. adalah jenis rumput laut cokelat yang banyak ditemukan di perairan tropis, namun belum dimanfaatkan secara optimal. Kandungan selulosa yang tinggi dalam Sargassum sp. dapat digunakan untuk menghasilkan selulosa nanokristal (CNC). CNC dapat digunakan sebagai bahan nano penguat bionanokomposit. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi asam sulfat yang optimum untuk mengekstraksi nanokristal selulosa dari Sargassum sp. CNC dari Sargassum sp. diekstraksi menggunakan metode hidrolisis asam dan sonikasi. Variasi konsentrasi asam sulfat pada proses ekstraksi CNC, yaitu 30, 40, 50, dan 60%. Karakterisasi CNC dilakukan menggunakan spektroskopi inframerah (FTIR), difraksi sinar-X (XRD), dan analisis termogravimetri (TGA). Analisis FTIR mengonfirmasi keberadaan puncak gugus fungsi khas CNC, termasuk C–O–C (\~1160 cm⁻¹), C–O (\~1050–1030 cm⁻¹), dan C–H β-(1→4)-glikosidik (\~897 cm⁻¹) sebagai sidik jari CNC. Hal ini menunjukkan bahwa CNC yang diekstraksi melalui hidrolisis asam sulfat memiliki perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan bahan baku Sargassum sp. Selain itu, hasil XRD menunjukkan bahwa hidrolisis asam berpengaruh pada berkurangnya daerah amorf pada CNC. Analisis XRD menunjukkan tingkat CNC tertinggi sebesar 77,6% pada hidrolisis asam sulfat 40%. Analisis termal menggunakan TGA dan DTG menunjukkan bahwa CNC yang diproses dengan hidrolisis asam sulfat 40% menghasilkan CNC dengan stabilitas termal yang meningkat, menunjukkan suhu dekomposisi termal sebesar 369,60 °C. CNC yang diisolasi dari Sargassum sp. berpotensi sebagai bahan pembuatan nanokomposit dalam berbagai aplikasi, misalnya bidang farmasi, pengemasan makanan, dan biomedis.